مبانی نظری و پیشینه پژوهشی آنالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ و بیان ناحیه C2 پروتئین 166CD در میزبان پروکاریوتی

با سحافایل در خدمت شما هستیم با «پیشینه پژوهشی و تحقیق و مبانی نظری آنالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ و بیان ناحیه C2 پروتئین 166CD در میزبان پروکاریوتی» که بطور کامل و جامع به این مبحث پرداخته و نیاز شما را به هرگونه جستجوی بیشتری برطرف خواهد نمود.

فهرست محتوا

فصل اول مقدمه

سرطان

آناتومی روده بزرگ

جنین شناسی روده بزرگ

1-4  سرطان کولورکتال

1-4-1 چه کسانی در معرض خطر هستند

1-4-2عوامل محیطی

1-4-3 عوامل ژنتیکی

1-4-4 عوانل دیگر در بروز سرطان

علائم و نشانها

1-5 غربالگری

1-6 تعیین مرحله بیماری

1-7 روش های درمانی

1-7-1 درمان موضعی

1-7-2 درمان سیستماتیک

1-7-3 کولونوسکپی

لاپاراسکپی

1-7-6جراحی باز

1-7-7 شیمی درمانی

1-7-8درمان بیولوژیکی

1-7-9 پرتو درمانی

1-7-9-1 انواع درمان با اشعه

1-8 ALCAM

1-9ویژگی های عمومیALCAM

1-10شناساییALCAM  به عنوان یک هدف با انکولوژی

مساله تحقیق

فصل دوم:مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1 نقش ALCAM در درمان سرطان

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 مواد مورد استفاده

3-1-1 باکتری مورد استفاده

3-1-2 پلاسمید

3-1-3 انزیم ها

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی.

3-1-5 انتی بیوتیک ها.

3-1-6 محیط کشت باکتری

3-1-7 ژل الکتروفورز

3-1-8 مواد شیمیایی.

3-1-9 وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی

3-2 انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه C2 پروتئین ALCAM.

3-2-1 استخراج توالی ناحیه C2 پروتئیین ALCAM

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization

3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیهC2 پروتئین ALCAM

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺ pBSK  حاوی DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM 30

3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته

3-4-1-1 مواد و محلول ها

3-4-1-2 روش کار

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10  E.coli..

3-4-2-1 روش کار

3-4-3 ارزیابی کلونی ها

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP⁺ pBSK  حاوی DNA ناحیه C2

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion

3-4-5-2 الکتروفورز35

3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM

3-5-1 تخلیص DNA ناحیهC2  از ژل

3-5-2 لایگیشن

3-5-3 ترانسفورماسیون

3-5-3-1 آماده سازی سلول های شایسته

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن

3-5-4 ارزیابی کلونی ها

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM

3-5-6 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده

3-6  بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM

3-6-1 القاء بیان پروتئین

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page

3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها

3-6-2-2 Run  کردن نمونه ها

3-6-2-3 رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی

فصل چهارم:نتایج

4-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی

C2ناحیهDNA4-2 سنتز شیمیایی

4-3کلونینگ پلاسمید AMP+ -pBSK حاویDNA ناحیهC2

4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه C2

4-5بیان پروتئینC2 و تایید آن به کمک تکنیک SDS_page

فصل پنجم:

بحث

منابع

فهرست شکل ها:

شکل 1-1 تصویر بخش های مختلف روده بزرگ

شکل1-2 نمای کلی روده بزرگ، روده کوچک و معده

شکل1-3 درصد فراوانی محل آناتومیک سرطان کولورکتال

شکل1-4 درصد فراوانی مراحل سرطان کولورکتال

شکل1-5 نقشه ژنتیکی پروتئین ALCAM

شکل1-6 رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمیایی ALCAM در بافت توموری

شکل3-1 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a

شکل3-2 دستگاه انکوباتور

شکل3-3 دستگاه اتوکلاو

شکل3-4 دستگاه مولد ولتاژو تانک الکتروفورز

شکل3-5 شیکر انکی باتور

شکل3-6 سانتریفیوژ

شکل3-7 دستگاه تصویر ساز ژل

شکل3-8 ترموسایکلر

شکل3-9 بن ماری

شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید

شکل3-11 کیت استخراج DNA از ژل فرمانتاز

شکل4-1 شاخص سازی کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی

شکل4-2 میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی سمت راست:بعد از بهینه سازی

شکل4-3 شاخص سازی محتوای G-C سمت راست:قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی

شکل4-4ترادف ناحیهC2 مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli

شکل4-5 مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده

شکل4-6 تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی

شکل4-7 نقشه ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیه C2 پروتئینALCAM

شکل4-8 تائید حضور پلاسمید حاوی ژن ناحیه C2 در محصول استخراج پلاسمید

شکل4-9 هضم دوگانه آنزیمی پلاسمید تکثیر یافتهPBSK

شکل4-10 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a

شکل4-11 باکتری های BL21(DE3) ترانسفورم شده با Pet28a حاوی ژن ناحیه C2

شکل4-12 تائید حضور پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2 در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)

شکل4-13 نتیجه حاصلهاز هضم آنزیمی دوگانه پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2

شکل4-14 بررسی بیان پروتئین ناحیه C2 به کمک تکنیک SDS-Page

 

مقدمه

1-1سرطان چيست

اصطلاح سرطان به تومورهای اطلاق می شود که می توانند به بافت های مجاور خود که از سلول­های سالم تشکیل میشوند حمله کنند توانایی مجاورت و هجوم سلول های توموری عامل طبقه بندی تومورها به دو دسته خوش خیم و بدخیم است اگر یک تومور بدخیم به یک رگ خونی یا لنفی برسد می تواند متاستاز دهد ودر بافت های دیگری رشد کند. نئوپلاسم(که معنی آن رشد جدید است) شکل غیر طبیعی رشد سلول­ها است و تومور، نئپلاسمی است که با وضعیت بیمار گونه همراه است، تومور ها بیماری هایی هستند که در آنها جمعیتی از سلول های، که به لحاظ ژنتیکی هم خانواده هستند توانایی رشد نا به هنجار را کسب می کنند(نخعی سیستانی وهمکاران 1389). همة سرطان ها از سلول ها شروع مي شوند كه واحد سازنده بدن و اساس زندگي محسوب مي شوند. سلول ها بافت را مي سازند و بافت هاي بدن، اندام ها را تشكيل       مي دهند. به طور طبيعي‌، سلول ها به گونه ای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد مي كنند و تقسيم مي شوند. سلول های  پير مي میرند وسلول هاي جديد جاي آنها را مي گيرند.

گاهي نظم مراحل رشد به هم مي خورد. سلول هاي جديد زماني كه لزومي به وجود آنها نيست، به وجود مي آيند و يا سلول هاي پير در زمان مرگ به حيات خود ادامه مي دهند. این سلول هاي اضافي توده بافتی به نام تومور تشکیل می دهند.

تومورها خوش خيم يا بد خيم می باشند.

تومورهاي خوش خيم سرطاني نيستند.

اين نوع تومورها به ندرت زندگی فرد را تهدید می کنند.

بیشتر تومورهای خوش خیم قابل جراحی بوده و معمولا عود نمی کنند.

تومورهای خوش خیم، به بافت هاي اطراف و ساير قسمت هاي بدن گسترش نمي يابند.

تومورهاي بدخيم سرطاني هستند.

عموما اين تومورها بسیار خطرناك تر از تومورهای خوش خیم بوده و زندگی فرد را تهدید  می کنند.

تومورهای بدخیم قابل جراحی بوده ولی در مواردی بعد از عمل جراحی مجددا عود مي كنند.

تومورهای بدخیم انتشار یافته و به بافت ها و اعضاي مجاور، آسيب می رسانند.

سلول های سرطانی از بافت توموري جدا شده و با وارد شدن در جريان خون يا سيستم لنفاوي، تومورهاي جديدي درسايراعضاء بدن تشكيل می دهند. گسترش و انتشار سلول هاي سرطاني به سایر بافت های بدن را متاستاز مي نامند.

زماني كه سرطان از بافت اصلي به ساير قسمت هاي بدن گسترش پيدا مي كند، تومور جديد شبيه همان نوع سلول هاي غير طبيعي تومور اوليه بوده و به همان اسم تومور اوليه خوانده مي شود. براي مثال اگر سرطان كولوركتال به كبد متاستاز دهد سلول هاي سرطاني كبد همان سلول هاي سرطاني كولوركتال بوده و بيماري سرطان متاستاتيك كولوركتال نامیده شده و همانند سرطان كولوركتال، درمان مي شود            (کاظمی اسکندانی 1388).

دانش کنونی از مکانیسم های سرطان پیشنهاد کننده این مطلب است که علت ایجاد همه­ی سرطان ها ناشی از هر دو عامل محیطی و ژنتیکی است(clapp et at 2005).

عوامل ژنتیکی، هورمونی و ویروسی روی سرطان تاثیر می گذارند باقی ماندن تغییراتی مانند آسیب بافتی، تغییرات ژنتیکی و اپی­ژنتیک(مثل جهش،از دست دادن هتروزیگوسیتی و متیلاسیون پروموتور)و تغییرات ترانسکریپتوم(مثل التهاب و مسیر های آپاپتوز) در دراز مدت منجر به فعال شدن مسیر ها و عملکرد های سلولی نابجا گشته و در نهایت منجر به تغییرات پیش سرطانی می گردد(Roy et el 2008).

انکوژن ها کد کننده پروتئین های هستند که کنترل کننده­ی تقسیم سلولی، آپاپتوز و یا هر دوی آنها هستند. آنها می توانند به وسیله تغییرات ساختمانی، که حاصل جهش یا اتصال ژن ها توسط کنار هم نشینی عناصر تحریک کننده و یا به وسیله تحریک فعال شوند. جا به جای و جهش می تواند به عنوان وقایع اولیه یا در طی پیشرفت تومور اتفاق بیفتد در حالی که تکثیر معمولا در طی پیشرفت اتفاق می افتد هنگامی که یک

انکوژن توسط جهش فعال می شود ساختار پروتئین کد شده توسط آن در مسیر افزایش فعالیت تغییر       می کند(croce2008).

جهش های که پروتوانکوژن ها را به انکوژن ها تبدیل می کند شامل:تغییرات تک نوکلئوتیدی،تکثیر یا ازدیاد ژنی، ترکیب ژنی و سایر بازآرایی های کروموزومی است که فعالیت پروتئین های ساخته شده توسط پروتوانکوژن ها را افزایش می دهند. جهش های تغییر دهنده قالب، جهش های بی معنی و جهش هایی که در جایگاه پردازش روی می دهند عموما موجب فعال شدن انکوژن ها نمی شوند(Thomas et al 2007).

سرطان بوسیله­ی تغییر در انکوژن ها، ژن های سرکوب گر تومور و ژن های microRNA ایجاد می شود

یک تغییر ژنتیکی به ندرت برای توسعه یک تومور بدخیم کافی است. بیشتر شواهد به یک فرآیند چند مرحله ای از تغییرات پی در پی در انکوژن های مختلف، ژن های سرکوب گر تومور یا ژن های microRNA در سلول های سرطانی اشاره دارند(croce 2008).

انکوژن ها شکل جهش یافته­ی یک ژن طبیعی سلولی به نام پروتوانکوژن ها است که در گسترش سرطان شرکت می کند انکوژن های که اغلب در رشد و گسترش سرطان های انسانی شرکت دارند به وسیله­ی ویروس ها منتقل نمی شوند بلکه در نتیجه جهش های سوماتیک در پروتوانکوژن ها ایجاد می گردند   (نخعی سیستانی و همکاران1389). پروتئین های حاصل از پروتوانکوژن ها در شرایط عادی عملکرد حیاتی در پیام رسانی سلول، رشد و تمایز بر عهده دارند اما بیان غیر طبیعی آنها قادر به القای تومور زایی است(pappou 2010).

یک ژن سرکوب کننده تومور نوعی ژن است که بوسیله­ی جهش های حذف عملکرد ایجاد می شود، ژن های سرکوب کننده تومور فرآیند های اصلی مسئول حفظ بخش های پایدار بافتی را کنترل می کنند این فرآیند ها شامل تمامیت ژنتیکی، پیشرفت چرخه سلولی،تمایز، برهمکنش های سلولی و مرگ می باشند. غیر فعال شدن این ژن ها موجب حذف هموستازی بافتی می شود که مشخصه یک تومور در حال گسترش است(نخی سیستانی و همکاران1389).

1-2 آناتومی روده بزرگ:

روده بزرگ از دریچه ایلئوسکال روده کوچک تا آنوس گسترش یافته است و شامل آپاندیس، کولون، رکتومو کانال آنال می باشد بنا به موقعیت کولون به قسمت های مختلف تقسیم شده است: سکوم، کولون

صعودی، زاویه­ی کبدی، کولون عرضی، زاویه طحالی، کولون نوزولی و کولون سیگموئید                    (میبدی و همکاران 1382، ACS 2010).

lanfatic

metastastic

colon

Rectom

annal

 

منابع

فريبا كاظمي اسکندانی زير نظر دكتر جمال عيوضي ضيائي مركز تحقيقات هماتولوژي انكولوژي دانشگاه علوم پزشكي تبريز زمستان 1388

میبدی ،موسوی ،مرادی 1382 (ترجمه) اصول جراحی شوارتز

نخعی سیستانی ،تفریحی ،شیرزاد 1389 اصول ژنتیک سرطان

حسین زاده ع ، دارایی ع ،1391، عوامل محيطي مرتبط با سرطان كولوركتال اسپوراديك، بيمارستان سيدالشهداي شهرستان اصفهان،مجله تحقیقات نظام سلامت،2: 229-236

American cancer soeiety:cancer fast figures

WC, Marquardt H, Neubauer M, Pesando JM, Francke U, Haynes BF and Aruffo A: Cloning, mapping, and characterization of activated leukocyte-cell adhesion molecule (ALCAM), a CD6 ligand. J Exp Med 181: 2213-2220, 1995.

Bowen MA and Aruffo A: Adhesion molecules, their receptors, and their regulation: analysis of CD6-activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM/CD166) interactions. Transplant Proc1995.

Bowen  MA , Pate DD, Li X, ModreU B, Malacko AR, Wang  C,Marquardt H,Neubauer M,Pesando J, Francke U,Haynes B,Aruffo A,1995, Cloning,  Mapping,  and  Characterization  of ActivatedLeukocyte-Cell  Adhesion  Molecule  (ALCAM), a  CD6  Ligand.J. Exp. Med ,181:2213-2220.

Bowen MA,Bajorath J, Siadak AW, Modrell B, Malacko AR, Marquardt H, Nadler SG, Aruffo A,1996, The Amino-terminal Immunoglobulin-like Domain of ActivatedLeukocyte Cell Adhesion Molecule Binds Specifically to the Membrane-proximal Scavenger Receptor Cysteine-rich Domain of CD6 with a 1:1 Stoichiometry. JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 29; 17390-17396.Bowen M.A, Aruffo A,1999,Adhesion Molecules, Their Receptors, and Their Regulation: Analysis of CD6-Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule(ALCAM/CD166) Interactions. Elsevier795-796.

Croce,C.M 2008 oncogenes and cancer the new englandjournal of medicins.

Cortes F, Deschaseaux F, Uchida N, Labastie MC, Friera AM,He D, Charbord P and Peault B: HCA, an immunoglobulin-like adhesion molecule present on the earliest human hematopoietic precursor cells, is also expressed by stromal cells in bloodforming tissues1999.

Degen WG, van Kempen LC, Gijzen EG, van Groningen JJ, van Kooyk Y, Bloemers HP and Swart GW: MEMD, a new cell adhesion molecule in metastasizing human melanoma cell lines, is identical to ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule)1998.

Dalerba P, Dylla SJ, Park IK, Liu R, Wang X, Cho RW, Hoey T, Gurney A, Huang EH, Simeone DM, Shelton AA, Parmiani G, Castelli C and Clarke MF: Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells2007.

Hall  N,2011, Colorectal cancer: features and investigation.MEDICINE 39: 250-253

Hisayuki,SH and Gazdar,A.F 2005 somatic mutation of epidermal growth factor receptor signaling pathway in lung cancer.

Horst D, Kriegl L, Engel J, Kirchner T and Jung A: Prognostic significance of the cancer stem cell markers CD133, CD44, and CD166 in colorectal cancer2009.

Kang,W ,Lee,S ,Jeon,E ,Yas.Y ,kim,K 2011 emerging role of vitamina colorectal cancer.

Kristiansen G, Pilarsky C, Wissmann C, Kaiser S, Bruemmendorf T, Roepcke S, Dahl E, Hinzmann B, Specht T, Pervan J, Stephan C, Loening S, Dietel M and Rosenthal A: Expression profiling of microdissected matched prostate cancer samples reveals CD166/MEMD and CD24 as new prognostic markers for patient survival2005.

Kolahdozan,SH ,Sajadi,A ,Radmard,AR 2010 five common cancer in iran.

King JA, Ofori-Acquah SF, Stevens T, Al-Mehdi AB, Fodstad O, Jiang WG,2004, Activated leukocyte cell adhesion molecule in breast cancer: prognostic indicator. Breast Cancer Res,6: 478-487.

Liu AY. Roudier MP, True LD,2004, Heterogeneity in Primary and Metastatic Prostate  Cancer as Defined by Cell Surface CD Profile. American Journal of Pathology, 165:1543–1556.

Levin  TG , POWELL AE, DAVIES PS, SILK AD, DISMUKE AD, ANDERSON  EC,et al,2010, Characterization of the Intestinal Cancer Stem Cell Marker CD166 in the Human and Mouse Gastrointestinal Tract. Gastroenterology, 139:2072–2082.

L evin TR, CONELL C, SHAPIRO JA. CHAZAN SG, NADEL  MR, SELBY J V,2002, Complications of Screening Flexible Sigmoidoscopy. Gastroenterology, 1 2 3 : 1 7 8 6 – 1 7 9 2.

Lieberman DA,2009, Screening for Colorectal Cancer, T h e n e w e ngl a nd j o u r na l o f m e dic i n e, 361:1179-87.

Ma Y, Peng J, Liu W, Zhang P, Huang L, Gao B, Shen T, Zhou Y, Chen H, Chu Z, Zhang M, Qin H.Mol Cell Proteomics. 2009 Proteomics identification of desmin as a potential oncofetal diagnostic and prognostic biomarker in colorectal cancer.

Malekzadeh,R ,Ansari,R 2009 epidemiology and molecular genetics colorectal cancer in iran.

Mulsow J, Merkel S, Agaimy A, Hohenberger W,.2011, Outcomes following surgery f or colorectal cancer with synchronous peritoneal metastases. British Journal of Surgery, 98: 1785–1791.Ni C, Zhang Z,Zhu X, ET AL,2013,Prognostic Value of CD166 Expression in Cancers of the

Digestive System: A Systematic Review and Meta-Analysis.journal.pone, 8 : 1-8.

Nikolic A,Kojic  S,Knezevic S,Krivokapic Z,Ristanovic M,Radojkovic D,2011.Structural and functional analysis of SMAD4 gene promoter in malignantpancreatic and colorectal tissues: Detection of two novel polymorphicnucleotide repeats.Cancer Epidemiology 35 : 265–271.

NooriDaloii MR, Fazilaty H, Tabrizi M,2013, Cancer metastasis, genetic and microenvironmentalfactors of distant tissue: a review article. Tehran University Medical Journal 11: 671-683

Ochwat D, Hoja-Lukowicz D and Lityńska A: N-Glycoproteins bearing beta1-6 branched oligosaccharides from the A375 human melanoma cell line analysed by tandem mass spectrometry2004.

OFORI-ACQUAH  SF, KING JA,2008, Activated leukocyte cell adhesion molecule: a new paradox in cancer. Translational Research., 151:122–128.

Patel DD, Wee SF, Whichard LP, Bowen MA, Pesando JM, Aruffo A and Haynes BF:1995 Identification and characterization of a 100-kDa ligand for CD6 on human thymic epithelial cells.

2005. W. Clapp, G. Howe, and M. J. Lefevre, Environmental and Occupational Causes of Cancer, a Review of Recent Scientific Literature, Lowell Center for Sustainable Production, Lowell, MA, USA, 2005.

Roy S Herbst, John V Heymach, Scott M Lippman New England Journal of Medicine 10/2008.

Ruan W, Sassoon A, An F, Simko JP and Liu B: Identification of clinically significant tumor antigens by selecting phage antibody library on tumor cells in situ using laser capture microdissection2006.

Swart GW: Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration 2002.

Swart GW, Lunter PC, Kilsdonk JW and Kempen LC: Activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM/CD166): signaling at the divide of melanoma cell clustering and cell migration? Cancer Metastasis 2005.

Safaee A, Moghimi-Dehkordi B, Fatemi SR, MaseratE,et al,2009, Risk of Colorectal Cancer in Relatives: A Case Control Study. Knowledge & Health, 4(1):12-15.

Thomas,K.R ,Alissa,C.B ,Debiasi,R.M ,Winckler,W ,Laframbiosis,T 2007 High-throughput oncogen mutation profiling in human cancer.

ULRICH H. WEIDLE1, DANIELA EGGLE1, STEFAN KLOSTERMANN1 and GUIDO W.M. SWART2 2Educational Institute WiNST, Faculty of Science, Radboud University Nijmegen,NL-6500 GL Nijmegen, the Netherland.

WEIDLE UH, EGGLE D, KLOSTERMANN S, SWART GW,2010, ALCAM/CD166: Cancer-related Issues. CANCER GENOMICS & PROTEOMICS 7: 231-244.

WEIDLE UH, EGGLE D, KLOSTERMANN S, SWART GW,2010, ALCAM/CD166: Cancer-related Issues. CANCER GENOMICS & PROTEOMICS 7: 231-244